应用数码相片鉴定西葫芦种子品种纯度试验报告,烟粉虱传播双生病毒机理研究

绝大多数植物病毒依赖于昆虫介体传播而流行危害。昆虫传播的植物病毒每年造成作物损失巨大。要切断昆虫传播,控制植物病毒病,必须了解昆虫传毒的机理。本文以烟粉虱与双生病毒的互作为基础,浅析了烟粉虱传播双生病毒的机理。

“感觉很奇妙,我很喜欢吃这里的蔬菜”,近日,被“关”在“大铁皮屋”里30
d的两名航天员中心研究员走出了密闭试验舱舱门,这也标志着我国首次受控生态生保集成试验取得成功。舱内种的蔬菜不但可以吃,还能够提供氧气并吸收二氧化碳,尿液处理后还能浇灌蔬菜。这项试验意义非凡,为未来建设月球基地和登陆火星人员实现生命保障自给自足走出了第一步。

西葫芦制、售种单位每年都要进行种子的纯度鉴定,制种生产用的亲本要事先鉴定,F1代杂交种纯度也要鉴定。目前,国内种子纯度鉴定所采用的最普遍、最可靠的办法还是田间种植,开花结小瓜的考察方式,工作量大,耗时长,且费工、占地。制种单位委托农户生产杂交西葫芦种子,种子收获后一般在10月中旬。一般田间种植鉴定种子纯度要对果实特征鉴别,依据时间推算,纯度鉴定结果将到春节之后才能出来。委托方答应纯度结果出来后付款,而制种农户希望在春节前拿到制种款,为化解这一供需矛盾,寻求快速、准确、有效的品种纯度鉴定方法,经过分析,笔者尝试从杂交种与亲本幼苗上寻找区别,以期达到快速鉴定品种纯度的目的。

烟粉虱属同翅目,粉虱科,小粉虱属,广泛分布于全球除南极洲外各大洲的90多个国家和地区,是棉花、蔬菜和园林花卉等植物的主要害虫之一。烟粉虱对寄主植物的为害主要表现在3个方面:
一是直接刺吸植物汁液,造成植株衰弱、干枯;二是分泌蜜露,诱发煤污病;三是传播植物病毒,诱发植物病毒病,所造成的危害比前两者要严重得多[1]。从国外的经历来看,烟粉虱大暴发后不久,其所传播的病毒病就会随之大发生。研究表明,许多新病毒的大暴发可能与烟粉虱的一个生物型——B型的大发生有关。与其他生物型相比,B型烟粉虱具有更广的寄主范围和更强的传毒能力。

两名研究员呆过的“大铁皮屋子”足有300
m3的空间,它是一个“两居室”,其中的大屋子用来种植生菜、油麦菜、紫背天葵和苦菊等4种植物,小房间是二人的生活空间,他们在这里可以吃饭、睡觉、健身,还能上网办公,两个房间的空气是互相流通的。这期间,植物的光合作用为他们提供了氧气,并净化了排出的二氧化碳,空气得到了完全平衡。试验舱所产生的冷凝水得到了100%的回收利用,而卫生废水和尿液达到了60%的回收利用,尿液回收处理后成为了植物的营养液。二人每天还是以航天食品为主,不过和太空中的航天员不同,他们在午餐时吃到了自己培育出来的新鲜蔬菜,当然吃的还只能是未经加工的凉菜。

1 材料和方法

双生病毒科(Geminiviridae)病毒是植物病毒中唯一一类具有孪生颗粒形态的单链环状DNA(single
stranded
DNA,ssDNA)病毒,简称双生病毒(geminiviruses)。大多数具有经济重要性的双生病毒为菜豆金黄花叶病毒属病毒(begomoviruses)。在自然条件下,菜豆金黄花叶病毒属病毒侵染双子叶植物,由烟粉虱传播,也称粉虱传双生病毒(whitefly-transmitted
geminiviruses,WTG)。近年来,随着B型烟粉虱的大发生,由烟粉虱传播的双生病毒已在多个国家和地区作物上造成毁灭性危害,且有逐年加重的趋势[2-4]。由于B型烟粉虱的大暴发及其所传病毒病危害的严重性,对WTG的研究也就随之增多。本文综述烟粉虱获取、携带及传播双生病毒的能力,以及烟粉虱对双生病毒的传毒方式和传毒特点等方面的研究进展。

据介绍,目前国际空间站已经实现了植物栽培,其他国家的航天员已经有望在不久的将来吃上自己种的蔬菜了。而我国真正飞上太空的航天员可能要多等一段时间。近日试验成功的生保系统属于第三代,未来将应用于我国的月球基地和火星基地当中。到那时,不但可以种植蔬菜,还可种植粮食、养殖动物等,让食物完全自给自足,所需氧气等也将通过植物获取。

1.1 试验材料

1 烟粉虱对双生病毒的获取和传播

杂交种hp400样品5个,每个样品500 g。母本h401,100粒。父本p402,100粒。

1.1 烟粉虱有效获毒及传毒所需的最短时间

1.2 试验设备

烟粉虱经卵和4个若虫期发育至成虫。烟粉虱的各个龄期均能摄取及传播双生病毒,如番茄黄化曲叶病毒(tomato
yellow leaf curl virus,TYLCV)、撒丁岛番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow
leaf curl Sardinia
virus,TYLCSV)等。在大田中,这些双生病毒均是由烟粉虱成虫传播的。

光照培养箱、电热鼓风干燥箱、1 800万像素单反数码相机。5 cm×5
cm纸杯。人工气候室。14格横格式分样器。

烟粉虱传播TYLCV于健康番茄植株及发病症状的观察表明,
最短的获毒及接种时间为15~30
min。而且,在对从中东地区包括埃及分离的TYLCV的研究中,也得到了相似的结论。烟粉虱获取番茄皱叶病毒(Chino
del tomato virus,CdTV)的最短时间为1
h。PCR扩增发现,烟粉虱在带毒植株上获毒5~10 min就可在其体内检测到TYLCV
DNA的存在[5],烟粉虱传毒5
min时即可在传毒位点处检测到病毒DNA的存在。以上报道显示,
烟粉虱有效获毒及传毒所需的最短时间与所获取的病毒种类有关,一般在5 min至1
h之间。

1.3 试验方法

1.2 病毒在烟粉虱体内的潜伏期

在实验室条件下,培育杂交种和亲本幼苗单株,至两片真叶展开。用高像素数码相机,在幼苗生长期每天在固定时间用微距、大景深设置拍摄照片1次。将数码相片导入计算机归类排列,观察放大的整体性状,充分查看细微的差别,比对品种之间对应部位的差异。寻找杂交种与亲本品种幼苗可能存在的差异。

病毒被烟粉虱摄取后,先要从烟粉虱消化道运输到唾液腺内,再在烟粉虱取食的过程中随唾液一起排出。双生病毒完成这一过程直到侵染敏感植株所需的时间称之为潜伏期。潜伏期不仅反映了病毒移动的速度,而且反映了烟粉虱积累足够的病毒粒子以有效传播病毒于健康植株所需的时间。潜伏期长短因双生病毒种类而异。例如,ToLCBV的潜伏期为6
h;南瓜卷叶病毒(Squash leaf curl virus,SLCV)的潜伏期为8 h;TYLCSV
的潜伏期为17~24 h;CdTV的潜伏期为17~22
h。一种病毒的潜伏期的改变可能与实验条件及媒介烟粉虱不同有关。例如,从以色列分离的TYLCV,1966年报道的潜伏期为21
h,35年后报道的潜伏期仅为8 h[6]。

1.3.1 取得籽粒影像

1.3 病毒在烟粉虱体内的存留

10月8日,将父母本及杂交种子20粒,平铺到紫色纸上,4×5方式排列,微距拍成5184×3456图片,存入计算机。比对差异。

获毒1~2
d后,双生病毒可在烟粉虱体内存留1至数周,有时可终身存在。SLCV及TYLCV可在烟粉虱的整个生活周期内存在,而TYLCSV却在获毒后20
d时就不能在烟粉虱体内检测到;ToLCBV可在烟粉虱体内存留长达12
d,但不能终身存在。我们研究发现,烟草曲茎病毒(tobacco curly shoot
virus,TbCSV)在B型烟粉虱体内至少可存留10
d,而中国番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl China
virus,TYLCCNV)可在B型烟粉虱体内终身存在。

1.3.2 取得亲本幼苗影像

大多数情况下,病毒DNA在烟粉虱体内存留的时间要长于带毒粉虱具有传毒能力的时间。例如,在烟粉虱获毒后20
d时,仍可在其体内检测到TYLCSV DNA, 而其传毒能力仅可持续8
d。病毒DNA及外壳蛋白(coat protein,CP)的检测表明,
它们在烟粉虱体内并不始终是同期存在的。获毒48 h后,TYLCV
DNA在烟粉虱的整个生活期均可检测到,而TYLCV CP的量却持续减少,至12
d时就检测不到。有研究表明,病毒外壳蛋白的消失与烟粉虱有效传播病毒能力的快速下降有关。

10月8日,将普通菜园土用设定温度160 ℃,60 min灭菌,冷却后装入5 cm×5
cm的纸杯,每个杯子侧面用记号笔标记序号、♂或♀标记,备用。

1.4
烟粉虱传毒效率与获毒时间、虫口密度和接种位点的关系烟粉虱对双生病毒的传毒效率与其获毒及传毒时间的长短有关。研究报道,无毒烟粉虱在感染TYLCV的番茄植株上取食获毒15
min不能够传毒,获毒30 min即可传毒并使30%的无毒植株感病,获毒4
h以上则可致90%无毒植株感病。也有研究报道,烟粉虱在感染TYLCV的番茄植株上获毒15
min时即可传毒,传毒效率随其获毒时间的延长而增加,于24
h时达到最高,使89%的植株感染病毒。此外,还得知烟粉虱传毒的最短时间为15
min,传毒效率随其传毒时间的延长而提高,于12
h时达到最高,使94%的植株感染病毒。

取父母本种子各20粒,用2%双氧水浸泡种子20
min,清水洗净。将父本单粒播于装好培养基的标记♂的纸杯,播种深度10
mm,每杯加入自来水20 mL,然后排列于15 cm×20
cm发芽盒加盖。母本用同样方法,播于装好培养基的标记♀的纸杯。放入25
℃的光照培养箱培养。

烟粉虱对双生病毒的传毒效率还随其个体数量的增加而提高。烟粉虱在获毒24
h后,单头带毒成虫即可将TYLCV传于健康番茄植株,使18.5%的植株感染病毒;
当传毒成虫的密度升至每株5头和每株15头时,植株感染病毒的比率就分别上升到74.2%和100%。Mehta也发现,当传毒烟粉虱的虫口密度由每株1头增加到每株5
头时,对TYLCV的传毒效率明显升高,植株感染病毒的比率由20%升至为81%,
当虫口密度增加到每株20头时,植株感染病毒的比率达97%。另外,在对SLCV
的研究中也得到了相似的结果,即烟粉虱获毒48
h后,单头烟粉虱即可将SLCV传于健康南瓜植株,植株感染病毒的比率达82%,当传毒虫口的密度由每株1头增加到每株5头或10头时,植株感染病毒的比率都达100%。

10月12日,幼苗顶土露头,15日下午父本子叶开始展开,16日下午父本子叶全部展开,母本子叶开始展开,17日母本子叶全部展开,光照培养箱培养温度调整为夜间18
℃,昼间22 ℃。

另外,烟粉虱对双生病毒的传毒效率还与在寄主植物上的接种位点有关。嫩叶及嫩叶尖端是烟粉虱传毒的最好位点,病毒能够在这些部位的接种点进行复制,并将病毒粒子首先运输到根部,然后运输到植株的新芽,最后运输到与接种叶片位置相邻的叶片和花,以老叶片为传毒位点时的传毒效率低。

父本从16日开始,母本从17日开始,每天下午拍摄1次,单株拍摄,分别是侧视和俯视图。真叶展开后,对真叶叶柄、叶正面、背面、叶缘拍摄。图片存入电脑比对。10月23日第2片真叶展开,10月27日结束试验。

1.5 烟粉虱获毒及传毒效率与虫龄及性别的关系

1.3.3 取得杂交种幼苗影像

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